杂环胺是氨基胺富含蛋白质的食品原料(如肉类等)在热加工过程中产生的一类有害物质。大量研究表明。酸对该类物质通过与DNA共价结合产生致癌、烘烤致突变毒性。牛肉国际癌症研究机构(IARC)1993年经将喹啉类，饼中包括2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，杂环作用5-f]喹啉(IQ)归为2A级致癌物，抑制2-氨基-3，氨基胺4-二甲基咪唑并[4，酸对5-f]喹啉(MeIQ)、烘烤8-MeIQx、牛肉2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4，饼中5-b]吡啶(PhIP)、杂环作用2-氨基-9H-吡啶并[2，抑制3-b1]吲哚(AαC)和2-氨基-3甲基-9H-吡啶并[2，氨基胺3-b]吲哚(MeAoαC)等归为2B级致癌物。流行病学研究表明，杂环胺的摄入会增加罹患食道癌、胃癌和胰腺癌等的风险，因此杂环胺的生成途径和减控受到越来越多的关注。
目前有研究表明。在食品体系中添加一些抑制剂可以抑制杂环胺的产生，如添加人工合成的抗氧化剂同。草药和茶叶提取物等天然提取物以及香辛料等。然而，合成抗氧化剂的安全性，以及在不同区域生长的草药/香料的成分不同和高纯度的天然抗氧化剂提取成本过高，都会限制其在食品工业中的使用。
氨基酸已广泛用于食品中以增加其营养价值。或通过与其它食品成分的美拉德反应来增强食品的风味。此外，有报道称美拉德反应产物(MRP)有许多健康益处，例如已发现葡萄糖和组氨酸的MRP具有自由基清除活性，并且已鉴定出葡萄糖一组氨酸MRP中具有强抗氧化物质旧。有报道称，一些氨基酸可以抑制杂环胺形成，如色氨酸、赖氨酸和脯氨酸可以显着抑制模拟体系中PhIP的形成，并通过添加氨基酸减少苯乙醛(美拉德反应中PhIP不可缺少的中间体)的生成。这表明它们可能通过清除苯乙醛抑制PhIP形成。另一项研究表明，在模拟体系中，200℃加热5min，可形成PhIP-甘氨酸加合物，这很可能是甘氨酸的羧基和PhIP的氨基进行脱水缩合；这项研究还发现，加热PhIP可以诱导其与其它各种氨基酸结合，表明氨基酸可通过形成加合物的形式抑制PhIP的形成。
本试验使用4种非杂环胺前体及在模拟体系中具有最强PhIP抑制能力的氨基酸—组氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸作为杂环胺抑制剂，添至待烘烤牛肉饼中，探究氨基酸对烘烤牛肉饼中杂环胺产生及其理化性质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
17种杂环胺标准品，包括PhIP、DMIP、去甲哈尔满(Norhaman)、哈尔满(Harman)、MeIQx、IQx、7，8-DiMeIQx、4，8-DiMeIQx、4，7，8-rniMeIQx、MeIQ、IQ、IQ[4，5-b]、Phe-P-1、1，5，6-TMIP、MeAo[C、A仪C、Glu-P-1，美国SantaCmz公司，所有标准品的纯度均高于99％；硅藻土、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸，百灵威公司(中国北京)，所有标准品的纯度均高于99％；OasisMCX(3cc/60mg)固相萃取柱，美国Waters公司；U-PLC-MS级乙腈、甲醇和甲酸，美国Thermo-Fisher公司；乙酸乙酯、甲醇、氨水、氢氧化钠为分析级，中国上海国药化学试剂有限公司；牛里脊肉，购于无锡欧尚超市。
超高效液相色谱串联四极杆质谱，使用Ac-quityUPLCBEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，美国Waters公司；visiprep型固相萃取仪，美国Sigma公司；氮吹仪，上海泉岛公司；电子天平，瑞士MettlerToledo公司；IKAT-18型均质机，德国IKA公司：烤箱RationalSCC61ESelf-cookingCenter，希基国National公司；Sigma3K15型冷冻离心机，美国Sigma公司。
1.2 试验方法
1.2.1 烘烤牛肉饼的制作
1) 空白组的制作
取绞碎牛里脊肉(40±0.1)g置于直径6cm培养皿上，制成约1cm厚的牛肉饼，225℃烤制20min(10min/面)。烤好的肉饼冷却后冻干。粉碎机粉碎，于-20℃冰箱贮存备用。每个样品做3个平行。
2) 试验组的制作
在空白组基础上，分别添加质量分数0.01％，0.05％和0.10％的组氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸于鲜肉中。其余制作与烤制方法同空白组，每个样品做3个平行。
1.2.2 烘烤牛肉饼基本组分的测定
样品中水分、蛋白质、脂肪和矿物质，pH值测定分别参照国家标准GB5009.3-2016《食品中水分的测定》、GB5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》、GB5009.6-2016《食品中脂肪的测定》、GB5009.4-2016《食品中灰分的测定》Ⅲ和GB5009.237-2016《食品pH值的测定》。
1.2.3 烘烤牛肉饼质构的测定
将肉饼切成1cm3的正方体，做双循环压缩试验，测定其硬度、凝聚性、咀嚼性和弹性。质构测定试验条件：预测试速度1.0mm/s。测试速度2.0mm/s，测试后速度2.Omm/s，应变力75％，触发类型为自动型，触发力5.0g。
1.2.4 烘烤牛肉饼中游离态和结合态杂环胺的测定
离态杂环胺的提取参考Chen等阎的方法。称取4g牛肉饼粉末，加入30mL1mol/L氢氧化钠溶液，均质1min，将肉糜转移至盛有14g硅藻土的三角瓶中，加入50mL乙酸乙酯，混匀后超声萃取2次。每次30min，所得上清液即游离态杂环胺提取液，用于固相萃取。固相萃取操作参考文献。
色谱条件：UPLCBEHC18(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；柱温45℃；流动相A为100％乙腈，流动相B为3mmol/L乙酸铵(pH4.75)；洗脱梯度：O～0.1min为4％A，0.1～18min为40％A，18～20min为70％A：20～22min为100％A；22～22.1min为4％A；流速0.3mL/min；样品室温度4℃；柱温45℃；进样量5μL。
质谱条件：电喷雾(ESI)电离源，正离子模式；选择多反应监测模式：离子源温度110℃：脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量(氮气)700L/h；毛细管电压3.5kV；锥孔气流量(氮气)50m；碰撞气流量(氩气)0.13mL/min；扫描范围2～2000u。
1.2.5 方法学验证
1) 线性范围
称取17种杂环胺标品各2mg，用色谱甲醇定容2mL，得到1mg/mLHAs单标母液，稀释10倍得到100μL工作液。将各单标溶液稀释后混合配制为混标溶液，稀释数倍后进行标准曲线测定。以HAs的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到各HAs质量浓度与峰面积间的线性回归方程。
2) 检测限和定量限
将上述不同质量浓度梯度的杂环胺混标溶液添加到空白牛肉饼中。提取后进样检测。当信噪比(S/N)为3和10时，所对应的标品质量浓度即此种杂环胺的检测限(LOD)和定量限(L0Q)。
3) 精密度
对照组样品中加入100μL一定质量浓度的杂环胺混标溶液，每组样品重复3次，测定杂环胺的含量，所得相对标准偏差(RSD)即精密度。
4) 回收率
向对照样品中加入100μL一定质量浓度的杂环胺混标溶液，提取并测定。用此结果减去对照组样品中原有的杂环胺含量，所得差值与加入杂环胺标品含量的比值即回收率。
1.2.6 数据统计
本试验均做3次重复，结果以平均值±标准偏差表示。色谱图用Masslvnx软件分析，显著性用IBMSPSSStatistics22分析，其它数据用MicrosoftExcel2018处理。
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